引用文本：周妍妍，南征，苏建荣，等.含氯消毒剂对纯化病毒RNA消除效果及影响因素研究[J].首都公共卫生，2022，16（6）：333-337.
周妍妍 南征 苏建荣 房琼琼王劲 佟颖 于礼基金项目：首都卫生发展科研专项（编号：2021-1G-3014）
作者单位：100050，首 都 医 科 大 学 附 属 北 京 友 谊 医 院 临 床 检 验 中 心（周妍妍，南征，苏建荣）；北京市疾病预防控制中心（房琼琼，王劲，佟颖，于礼）
(相关资料图)
通信作者：于礼，E-mail：wersdu@163.com
摘要
目的 研究含氯消毒剂对病毒RNA的消除效率，对其影响因素进行分析。方法 以纯化流感病毒RNA作为研究对象，对前期研究有效的含氯消毒剂，基于化学成分、作用浓度及时间、载体特性等因素进行分析，以荧光定量聚合酶链反应（PCR）反映消除效率。结果经中和剂鉴定试验选用含0.5%硫代硫酸钠的磷酸盐缓冲液（PBS）中和残留消毒剂后，实验结果表明以有效氯含量为500mg/L含氯消毒剂可实现对RNA的完全清除，且不同化学成分、不同类型载体对消毒剂清除效率的影响较小，进一步降低作用浓度至10mg/L，经浸泡作用5min也能实现对RNA污染的有效清除。模拟现场测试表明，玻璃、塑料和桌面上的RNA污染均可经1000mg/L含氯消毒剂以擦拭或喷洒消毒的方式去除，而仅以物理擦拭或冲刷的方式未能清除RNA污染。结论 与物理擦拭方式相比，含氯消毒剂充分接触作用后对纯化的病毒RNA具有很好的消除效果。
关键词
含氯消毒剂；RNA去除效率；模拟现场试验
2019年底以来，新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID- 19，以下简称新冠肺炎）疫情在世界范围内蔓延，我国坚持常态化精准防控和局部应急处置有机结合，使疫情得到有效的控制[1]。在疫情防控中，环境核酸检测阳性屡见报道，依据《新冠肺炎疫情期间现场消毒评价标准：WS/T 774-2021》的规定[2]，病毒核酸检测结果不可作为消毒效果评价的指标，但作为既往污染指标，在疫情防控中如核酸检测实验室、集中观察隔离点、进口冷链外包装等，将会极大影响处置工作，给疫情防控造成了干扰[3-4]。前期研究显示，含氯消毒剂对病毒RNA具有良好的消除效果[5]，本研究从含氯消毒剂的化学成分、作用浓度及时间、载体特性等因素出发，深入分析含氯消毒剂对纯化病毒RNA的作用效果。1
材料与方法
1.1 材料
实验用病毒株为维多利亚系乙型流感病 毒，病毒提取试剂盒QIAamp Viral RNA mini kit（德国QIAGEN公司），流感病毒甲/乙核酸双重实时荧光PCR检测试剂盒（北京卓诚惠生生物科技股份有限公司）。ABI 7300型实时荧光定量PCR仪（美国ABI公 司）。制备RNA污染载体包括玻片、纸片、布片或不锈钢圆片四种类型。对不同特性表面测试的模拟现场试验选择玻璃平皿、塑料平皿、不锈钢板和桌面。
测试用含氯消毒剂包括次氯酸钠消毒液（有效氯含量4.25%~5.75%）、二氯异氰尿酸钠粉剂（54% - 57%）、三氯异氰尿酸为片剂（35%±3.5%）、漂白粉 （28%~35%），以常量喷洒和擦拭的方式进行消毒。商品化的核酸处理产品RNA Away（碧云天生物技术有限公司）作为核酸清除对照。
1.2方法
1.2.1 RNA模拟污染的制备：病毒培养液按试剂盒说明提取RNA，经Nanodrop测定RNA浓度为18.2ng/μL取样液5滴染于不同载体上，置于37℃恒温干燥30min备用。模拟现场试验污染选取5cm×5cm区域，取稀释后病毒RNA样液20滴染于不同表面上，然后用无菌棉拭子涂布均匀，晾干后进行测试。
1.2.2 残留消毒剂的去除方法：为客观反映化学消毒剂的核酸清除能力，参照卫生部关于印发《消毒技术规范）（2002年版）的通知，中和剂鉴定试验以含0.5%硫代硫酸钠的磷酸盐缓冲液（PBS）作为中和剂进行化学中和[6]。试验分为6组：①消毒剂+病毒 RNA；②（消毒剂+病毒RNA）+中和剂；③（消毒剂+中和剂）+病毒RNA ；④中和剂+病毒RNA；⑤病毒RNA；⑥未接种病毒RNA的玻片，评估中和剂、中和产物对荧光定量PCR扩增体系的影响。
1.2.3 对载体上病毒RNA清除测试：试验方法按照文献[5]进行。为研究含氯消毒剂不同化学成分的影响，分别选取次氯酸钠、二氯异氰尿酸钠、三氯异氰尿酸、次氯酸钙测试，有效氯含量为500和1000mg/L；为研究消毒剂清除的影响因素，针对三氯异氰尿酸分别以不同作用浓度（10、20、100和500mg/L）、不同作用时间（1、5和10 min）在室温20℃下进行测试；为研究不同载体特性对清除的影响，分别选取玻片、纸片、布片和钢片4种载体测试。实验用PBS代替消毒剂作为阳性对照，未染病毒RNA的载体作为阴性对照， 从试验开始时就暴露在试验环境中，试验结束后取样检测。
1.2.4 对模拟污染台面上病毒RNA的清除测试：在室温20℃下，针对4种材质在5cm×5cm范围内模拟污染RNA，分别以含氯消毒剂用1000和2000mg/L擦拭和喷洒作用，同时用PBS代替消毒剂为阳性对照，未染病毒RNA的台面为阴性对照，另以生理盐水擦拭或冲刷作为对照，作用时间10min后，用无菌棉拭子涂抹采样，放入含有2mL中和剂的采样管中，剧烈震荡混匀后，静置中和10min，进行反转录聚合酶链反应（RT-PCR）测试。
1.2.5 荧光定量：PCR体系的建立：荧光PCR检测按文献[4]进行，对载体处理后的洗脱液和模拟污染表面的采样液，均取5μL加入15μL PCR反应液中进行检测，以Ct值作为清除效率的评估指标。清除试验重复3次，结果取Ct平均值进行评价。
2
结果
2.1 残留消毒剂的去除效果
参考中和剂鉴定试验，采用化学中和法去除残留消毒剂。以次氯酸钠消毒液、二氯异氰尿酸钠、三氯异氰尿酸、次氯酸钙4种 含氯消毒剂，有效氯含量均为1000mg/L，在中和作用后样品经RT-PCR检测，结果显示，各消毒剂试验第1组与第2组结果基本相似，除次氯酸钙Ct值为40左右外，第1组和第2组RT-PCR结果均为阴性，无病毒核酸检出，初步提示消毒剂清除效果较优。各消毒剂第3、4、5组的检测结果均为阳性，Ct值相近且均在30左右，因此判定含0.5%硫代硫酸钠的PBS作为中和剂，对4种含氯消毒剂均可有效中和，中和剂及其相应的中和产物对PCR反应体系无显著影响。
2.2 不同化学成分对RNA清除的影响
为进一步测试含氯消毒剂对RNA的清除能力，选取上述4种不同化学成分的含氯消毒剂进行测试。次氯酸钠、二氯异氰尿酸钠和三氯异氰尿酸3种消毒剂以500或1000mg/L作用10min，均能有效清除玻片载体上模拟污染的RNA，而500mg/L漂白粉作用10min后，与阳性对照结果相比，Ct差值平均上升6.73，1000mg/L漂白粉作用10min后Ct值＞40，基本达到清除。RNA Away对载体表面污染的RNA可有效清除（表1）。
2.3 不同浓度和时间对RNA清除的影响针对含氯消毒剂的RNA清除能力，选取三氯异氰尿酸进一步测试，评价消毒剂不同作用浓度及时间的影响。含氯消毒剂以10mg/L浸泡作用5min以上，即能完全清除玻片载体上模拟污染的RNA。将含氯消毒剂作用时间缩短至1min，500mg/L也可完全清除RNA，其他3个浓度对玻片上RNA清除效果存在一定波动，可实现大部分清除，但可能存在微量残留（表2）。 2.4 不同载体对RNA清除的影响将提纯的RNA模拟污染玻片、纸片、布片或不锈钢圆片4种载体，以含氯消毒剂常用浓度500和1000mg/L浸泡作用10min，对RNA清除的结果显示，各组Ct值均为阴 性，表明当含氯消毒剂有效氯浓度为500mg/L以上，作用时间10min，对不同载体上的RNA均可完全清除。 2.5 对RNA污染清除的模拟现场试验针对不锈钢、玻璃、塑料和木质台面，以病毒RNA污染后进行模拟现场测试的结果如3表所示，除钢材质外其他3种材质表面的RNA污染均可被彻底清除，说明1000mg/L含氯消毒剂以擦拭或喷洒消毒的方式能有效去除RNA污染。不锈钢表面的RNA污染经1000mg/L含氯消毒剂以擦拭或喷洒消毒作用后，可能存在少量残留，通过增加消毒剂浓度或重复3次擦拭的方式可以达到完全清除的目的。另外，试验中发现足量消毒剂的充分接触是确保有效清除的前提因素。 2.6 物理方式对RNA清除能力以单纯物理方式进行作用的效果测试表明，单纯以生理盐水进行一次物理擦拭，4种材质表面上残留的RNA检测结果，与阳性对照结果相比，Ct值分别上升了约4.31、1.40、5.54和1.86，重复进行3次物理擦拭后，4种材质表面上残留的Ct值相比一次物理擦拭结果，又分别上升了1.61、5.23、2.48和3.97，说明物理擦拭能够去除一部分物体表面上的RNA污染，重复擦拭也能进一步提升去除效果，但始终未能彻底清除RNA污染。同样对污染表面以流动水冲刷后，检测结果Ct值，与阳性对照结果相比，分别上升了0.68、1.78、7.40和0.87，显示未能彻底清除RNA污染，清除能力弱于物理擦拭。另外，试验结果显示物理方式3次重复试验之间Ct值存在一定的差异，但RNA清除能力偏弱。3
讨论
3.1 从核酸清除的意义看，在新冠肺炎疫情的常态化防控中，环境及物体表面检出病毒核酸阳性的情况屡见报道，特别是有新冠肺炎患者居住过的病家或隔离点房间，经过严格的终末消毒之后，环境采样一旦出现阳性，虽然病毒存在活性的可能性低，但会给后续入住人员带来隐患，同时也可能会干扰流行病学调查和溯源等疫情防控工作。因此，有效地清除环境及物体表面可能残存的病毒核酸，选择有效的处置方法尤为重要。
3.2 为科学判定核酸清除效果，本研究引入化学中和这一环节，参照消毒剂中和剂鉴定试验方法，去除残留消毒剂对RT-PCR检测的影响。李云龙等[7]对分子诊断实验室去除核酸污染的方法学进行研究，0.1% 84消毒液可有效清除液体中及不同材质表面污染核酸的大肠杆菌RNA。陈茂义等[8]采用悬液定量试验研究不同浓度含氯消毒剂对新冠病毒核酸的破坏效果，结果表明1000和2000mg/L有效氯消毒剂作用30s以上，750mg/L作用15min以上，能破坏新冠病毒核酸，而500mg/L有效氯消毒剂作用30min，Ct值升至约35，但不能完全破坏新冠病毒核酸。本研究发现，含氯消毒剂以10mg/L浸泡作用 5min以上，即能完全清除玻片载体上污染的RNA，只要保证足量消毒剂与RNA充分接触，低浓度短时间作用就能显示了强效清除能力。本研究以试剂盒纯化病毒RNA为研究对象，直接与各种消毒方式相互作用，无病毒包膜和结构蛋白的包裹，而通常情况下消毒剂首先要破坏病毒的脂质包膜层和病毒衣壳，最后才能与病毒核酸作用。漂白粉是氢氧化钙、氯化钙和次氯酸钙的混合物，其主要成分是次氯酸钙，溶于水后溶液呈浑浊状，可能由于其中不溶的颗粒物干扰了消毒剂与病毒RNA的作用。除了漂白粉清除病毒 RNA作用稍弱，其他3种含氯消毒剂均能有效清除病毒RNA，提示其清除作用的主要因子依赖于HCIO分子，以其氧化作用、新生态氧作用、氯化作用发挥效果[9]。前期研究显示，过氧化物氧化作用难以清除RNA，提示对RNA清除可能依赖于非氧化性的作用机制。
3.3 国内外关于医疗机构中消毒后环境中病毒核酸检测的影响也有相关报道，Zhang等[10]报道一家医疗机构在清洁消毒后对51间病房采集环境样品，新冠肺炎病毒核酸阳性率为32.1%，其中78.7%地面、23.0%高频接触表面及8.5%低频接触表面，病毒载量中位数为193.1 (90.0~612.8)个拷贝数，虽然终末消毒后病毒污染率呈现下降趋势，但未能彻底清除病毒RNA。有研究发现，新冠肺炎患者病房中在清洁前67%的表面检出新冠病毒RNA，而经过有过氧化氢和过氧乙酸擦拭后表面检出率仅为22%，短波紫外线照射结合表面擦拭将RNA检出率由50%下降到8.3%，而含氯消毒剂经静电喷洒结合擦拭使阳性检出率由100%下降到50%[11]。有研究人员对其医疗机构用醛类消毒剂和过氧化氢干雾终末消毒后，在COVID-19重症监护室表面未检测出新冠RNA[12]。在前期研究中对纯化病毒RNA作用后显示，含氯消毒剂、二漠海因作用后RNA均为阴性，而5种过氧化物消毒剂及二氧化氯仅部分清除，乙醇、季铵盐及紫外线照射消毒，对病毒RNA的清除效率很弱[4]。应注意的是，本研究是在实验室条件下各参数相对确定的实验结果，而医疗机构现场检测中可能存在一些不确定因素，如采样点选择、环境中普遍存在RNA酶等会对结果产生干扰。
3.4 为进一步模拟现场环境，本研究对钢材、玻璃、塑料和桌面上涂抹污染RNA的测试，1000mg/L含氯消毒剂基本可清除各表面的RNA，表现出高效的RNA去污能力。在模拟测试中消毒剂过量喷洒，对表面足量且完全覆盖至关重要，试验中发现如因消毒剂未充分接触作用，很有可能导致Ct值阳性检出。有研究报道，针对不同材质表面的核酸残留，84消毒液表现出了较好的清洁能力，但75%乙醇清洁能力未达预期，而且对于不同材质表面的清洁效果差异较大, 提示对于实验台、墙面、地面要反复多次处理[5，13-14]。本研究中含氯消毒剂1000mg/L喷洒和擦拭钢片上的RNA，3次重复试验中有2次检出残留RNA，可能与钢片载体的表面特性有关，消毒剂在钢片表面汇聚呈液滴状，可能影响了消毒剂与RNA的接触作用。单纯以物理方式未能清除RNA污染，单次擦拭能够去除一部分的RNA污染，重复擦拭也能进一步提升去除效果，但始终未能彻底清除，提示在疫情防控现场可将含氯消毒剂与物理擦拭相结合，实现对环境核酸的有力清除。
综上，本研究针对含氯消毒剂对病毒RNA消除能力，从化学成分、作用浓度及时间、材质影响等方面进行深入分析，也为疫情防控阳性处置策略提供了依据，具有较好的应用意义。为了保证测试的严谨性，本研究在商品化荧光PCR检测试剂盒的基础上，另行设计引物和探针，平行测试后结果基本一致。应注意的是，完整病毒结构及现场环境中各种影响因素都可能干扰核酸清除效果，后续将进一步就含氯消毒剂在模拟现场条件下对完整的病毒颗粒进行研究，以便于更好地指导实际工作。
参考文献
扫码关注我们
北京预防医学会
交流学术成果传播健康知识
